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论文

作者: 时间:2009-09-20 点击数:

蒺藜皂苷在小剂量多次注射STZ所致I型大鼠糖尿病模型中的降糖作用
高宇囡 

  【导言】随着生活水平的日益提高,高脂高糖饮食的过度摄入,糖尿病患者与日俱增。糖尿病(中医称消渴症),是因人体胰岛素失调,内分泌紊乱引起的体内糖代谢异常所致,其典型临床表现为三多一少,引起肾功能衰退,肢体麻木,脑血管微血管等多种并发症,西医一般采用常规保守疗法,只能起到降糖和巩固作用,不能从根本上调理脏腑功能,达到治愈目的,再加上患者思想压力过重,久病体虚,免疫功能低下,造成治愈的困难,故为医学界的疑难症。

  中草药作为抗糖尿病药物具有可综合调理,毒副作用小,可以长期应用或作为辅助药物降低其他药物的不良作用。

  蒺藜是一种古老的中草药,蒺藜(TribulusterrestrisL.)又称白蒺藜,刺蒺藜,系蒺藜科(zygophyllaceae)蒺藜属植物,具平肝解郁,活血祛风,祛痰止咳,明目,利尿,止痒之功效, 历代医书多列为上品,为中国药典1985年版所收载。临床用于治疗头痛,头晕,气管炎,目赤多泪,高血压,皮肤瘙痒和风疹等症,在治疗心脑血管性疾病方药的组方中应用颇多。最近,以蒺藜有效成分为主的制剂在防治心脑血管疾病,抗衰老和治疗性功能减退症等方面均显示出良好疗效。近年发现有降糖的新功效,但其机制尚不明确。

  【可能机制】STZ是一种含亚硝基化合物,能特异性破坏胰岛β细胞,机制之一是通过诱导NO的合成增加对胰岛β细胞的氧化侵袭,与IDDM病人发病时体内氧化侵袭增加相类似。小剂量STZ注射破坏少量胰岛细胞,死亡胰岛细胞作为抗原被巨噬细胞吞噬,产生TH1刺激因子(IL-12),使TH1细胞系占优势而产生IL-2及IFN-γ,在胰岛局部促使炎性细胞浸润,并活化释放IL-1β、TNF-α、IFN-γ及氧自由基NO、H2O2、O2,杀伤少量细胞,死亡细胞再次以自身抗原释放,并再次递呈给APC细胞进行处理。释放细胞因子,放大细胞损伤效应,最终导致IDDM。

  蒺藜中含有过氧化氢酶,可以提高SOD活性,抑制MDA含量而具有抗氧化作用,清除氧自由基及抑制其产生,从而防止受损细胞钙超载,阻止其引起的细胞调亡,减轻胰岛B细胞的氧化损伤。在高血糖病理状态下,刺激胰岛ß细胞分泌胰岛素,降低血糖和血脂及抑制糖异生。

  在糖尿病动物模型中常可见血清睾酮含量明显下降。蒺藜提取物还可以升高血清睾酮含量。睾酮进入靶细胞后可与受体形成复合物,随后再转移至细胞核内与染色质作用引起有关基因开放,促进核酸合成,还可以刺激组织摄取氨基酸,进而引起蛋白质合成加强,还可减少蛋白质分解,提高机体酶的分子数及其活性,加强磷酸肌酸合成,促进糖原合成,降低血糖水平,促进脂类分解,改善糖尿病引起的继发病变如动脉粥样硬化,糖尿病肾病,视网膜病变等。

  【方法】

  健康Wistar大鼠100只,雌雄各半,体重100~150g。大鼠分为对照组和实验组,对照组20只大鼠,腹腔注射pH4.4枸橼酸钠缓冲液;实验组40只大鼠腹腔注射pH4.4枸橼酸钠缓冲液配1.25%STZ,按30mg/kgBW剂量给药。每周注射1次,连续注射4周。单笼饲养,饮用自来水,自由摄食,饲以大鼠常规颗粒饲料。观察饮水进食情况,每周测试体重、尿糖1次,使用末梢全血血糖测试仪,采尾血监测造模前后血糖水平。约6周后大鼠造模成功。

  实验组分为四组,每组20只,一组正常饲养作为阳性对照组,其余三组分别以20mg/kg,40mg/kg,80mg/kg分为低剂量组,中剂量和高剂量组给予蒺藜皂苷提取物每天灌胃一次,连续4周,检测各项指标。

  【预期结果】

  与对照组相比实验组均出现血糖升高的现象,人为造成大鼠糖尿病。

  应用蒺藜皂苷提取物后其相对阳性对照组:

  血糖水平下降

  血脂水平下降

  各类炎症因子水平下降

  血清睾酮含量上升

  SOD活性上升

  MDA含量下降


         蒺藜皂苷在小剂量多次注射STZ所致I型大鼠糖尿病模型中的降糖作用

高宇囡 

  【导言】

  糖尿病(中医称消渴症),是因人体胰岛素失调,内分泌紊乱引起的体内糖代谢异常所致,其临床表现为三多一少以及无三多一少症状,引起肾功能衰退,肢体麻木,脑血管微血管等多种并发症,西医一般采用常规保守疗法,只能起到降糖和巩固作用,不能从根本上调理脏腑功能,达到治愈目的,再加上患者思想压力过重,久病体虚,免疫功能低下,造成治愈的困难,故为医学界的疑难症。STZ可在大鼠身上制造糖尿病模型,被广泛用于探索糖尿病发病机理。近来有研究显示蒺藜皂苷有降血糖作用及对抗其他糖尿病并发症的功效。

  【关键词】

  STZ  糖尿病  蒺藜皂苷

  【主要内容】

一.链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病

1.     建立模型

  ⑴小剂量STZ诱导大鼠Ι型糖尿病

  健康Wistar大鼠50只,雌雄各半,体重100~150g。大鼠分为对照组和实验组,对照组10只大鼠,腹腔注射pH4.4枸橼酸钠缓冲液;实验组40只大鼠腹腔注射pH4.4枸橼酸钠缓冲液配1.25%STZ,按30mg/kgBW剂量给药。每周注射1次,连。观察饮水进食情况,每周测试体重、尿糖1次,使用末梢全血血糖测试仪,采尾血监测造模前后血糖水平。大鼠造模4周后,于第5周断颈处死,取胰腺固定,HE染色观察病变。

  ⑵小剂量STZ并高糖高脂饮食诱导大鼠Ⅱ型糖尿病

  小剂量STZ注射诱导糖尿病 高糖高脂饮食一个月后,B组和D组大鼠腹腔注射25mg/kgSTZ(以pH4 2的0 1mol/L枸橼酸缓冲液配成0 25%浓度),A组和C组仅注射枸橼酸缓冲液作对照。于注射后第一、二、四周测定24h摄食量、体重、非禁食血糖、血浆胰岛素、以及血甘油三酯、胆固醇水平另外于STZ注射后第四周作血压测定,以及胰岛素抑制试验。

2.     结果

  ⑴一般情况

  模型组大鼠自注射2周后饮水量明显增加,约为造模前2~3倍,进食量也明显增加, 但体重增长缓慢。

  ⑵大鼠尿糖测试结果

  注射STZ第1周有少数大鼠出现尿糖阳性3+。第2次注射STZ后,较多大鼠出现尿糖阳性3+。第3次注射STZ, 更多大鼠尿糖阳性,占总数60%。第4次注射后绝大多数尿糖阳性3+。

  ⑶大鼠血糖测试结果

  大鼠空腹血糖测试结果表明,模型组大鼠血糖明显高于对照组。

  ⑷胰腺组织学观察

  肉眼观胰腺表面充血,颜色暗红。镜下见胰岛毛细血管扩张、充血,胰岛细胞减少,胰岛可见以淋巴细胞、单核细胞为主体的炎细胞浸润。胰岛β细胞空泡变性,使胰岛呈空虚状态。

  ⑸ 胰岛素敏感性

  大鼠在高糖高脂饮食后一个月发生高胰岛素血症、高血糖,说明已成功诱发出胰岛素抵抗。胰岛素抑制试验进一步证实这一结论。SSPG及SSPI水平明显高于常规饲料组。在STZ注射后四周,高糖高脂饲料喂养+STZ注射组(D组)SSPG水平进一步升高,但SSPI水平略有下降,说明胰岛素抵抗继续存在。      

  3.     其他并发症

  糖尿病可伴有白内障,糖尿病性心脏病,糖尿病肾病,视网膜病变等多种病变。

  ⑴血管并发症

  高血糖是糖尿病血管并发症主要原因之一,持续高血糖可使众多蛋白质与葡萄糖进行非酶促糖基化反应最终形成糖基化终末产物,这些产物可通过相应受体或非受体途径引起糖尿病血管功能异常;同时持续高血糖使细胞多元醇代谢途径活性增加,葡萄糖转运子1(Glut1)转运入细胞内,通过醛糖还原酶使细胞内山梨醇和果糖水平增高,山梨醇通路通过影响肌醇代谢及激活PKC和Na+-K+-AT酶影响细胞代谢,导致糖尿病并发症(包括DR)的发生。高血糖激活DAG-PKC系统具有组织特异性,主要发生在视网膜,主动脉,心脏,肾小球等组织。

  ⑵视网膜病变

  大鼠视网膜组织PKC蛋白表达,位于视网膜神经节细胞浆的内外丛状层轴突中;糖尿病大鼠PKC蛋白表达数显著升高,与对照组比较差异有显著性意义(P<0.01)。说明高血糖具有促使糖尿病大鼠视网膜组织PKC激活的作用。高血糖可使糖尿病大鼠视网膜凋亡抑制基因bcl-2蛋白表达降低"诱发视网膜神经节细胞,mller细胞,周细胞等发生凋亡,促进糖尿病视网膜病变的发展。视网膜病变:普通石蜡切片:可见视网膜节细胞层及内核层水肿,尤其是在静脉血管周围,细胞排列紊乱,但未见出普通石蜡切片:可见视网膜水肿较3个月重,尤其内核层"细胞排列紊乱,内核层血管周围水肿更明显。光镜可见:节细胞数量减少,静脉扩张,渗出,并有出血视网膜血管铺片:低倍镜下毛细血管网分布不均,可见毛细血管无灌注区,并可见多数闭塞的无细胞毛细血管。高倍镜下可见毛细血管管径粗细不均重于3个月组,闭塞的毛细血管既无内皮细胞也无周细胞,管腔闭锁,管径粗细不等,管壁边缘不规则,其周围可见扩张的毛细血管。并可见多处毛细血管栓塞形成。周细胞核染色加深,数量明显减少,与正常组对比,具有统计意义。电镜下可见:基底膜结节性增厚,断裂缺失,电子密度不均;内皮细胞肿胀变形,突入管腔,管腔明显狭窄,核形态不规则,异染色质浓集,居边,吞饮小泡增多;周细胞核异染色质浓集,居边,粗面内质网及线粒体肿胀变性,甚至呈空泡状。视细胞外节盘膜结构分离,排列紊乱,内节线粒体肿胀。

  ⑶血清睾酮降低

  随着糖化血清蛋白的升高,血清睾酮逐渐降低,随着血糖、糖化血清蛋白的升高,糖尿病各组的睾丸、附睾、精囊腺、前列腺重量呈现降低趋势,以精囊腺、附睾和前列腺降低最为明显。血清睾酮水平降低因素有以下几个方面:①胰岛素分泌的不足导致间质细胞表面LH受体数目降低[3],导致睾酮合成分泌下降;②糖代谢障碍时,间质细胞内溶酶体活性增加,导致滑面内质网功能失调,使其含17A-羟化酶和3B-甾类羟化脱氢酶系统功能降低,导致睾酮前体物质向睾酮转化生成的能力降低;③糖尿病时垂体-睾丸轴调节紊乱,导致黄体生成素和卵泡刺激素下降,最终导致睾酮水平下降。睾酮作为雄激素,在性腺器官的发生、分化、增长的不同阶段扮演十分重要角色,并决定着性腺器官的结构和功能的完整。研究结果显示:精囊腺、前列腺重量与血糖、糖化血清蛋白负相关,与血清睾酮正相关。提示精囊腺、前列腺重量变化除与糖尿病代谢紊乱有关外,还与血清睾酮下降密切相关。

  ⑷主动脉内皮细胞病变

  电镜观察发现糖尿病大鼠在8周时,主动脉内皮细胞的线粒体肿胀,空泡变,这可能是由于高血糖引起细胞能量代谢障碍。由于基膜成分是由内皮细胞合成的,主动脉内弹性膜增厚,则可能是由于AnⅡ和ET-1增加后刺激原癌基因和生长因子的表达,从而促进内皮细胞的增殖与肥大。Movre等[8] 时糖尿病对照组(DC)主动脉内皮细胞有大量溶解坏死,内弹性膜有局限性溶解断裂。其机制不十分清楚,可能是:①长期高血糖抑制内皮细胞DNA合成,从而影响内皮的更新;②内皮细胞膜和内弹性膜蛋白的糖基化使其更容易受损;③缺氧状态下的自由基损伤;④糖尿病的血管内皮细胞对高血压或血流切变应力的机械性损伤更敏感。这种内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化形成和发展以及血栓形成的基础。

  4.机制

  ⑴STZ诱导大鼠Ι型糖尿病

  IDDM是一种自身免疫性疾病,在疾病发展过程中胰岛β细胞的破坏是一个缓慢渐进的过程,与病程的长短有一定的相关性。近年发现,在IDDM发病过程中,不同阶段胰岛淋巴细胞浸润的数量、种类、表达细胞因子的种类及β细胞破坏的程度都不同。IDDM发病的自身免疫过程与TH1和TH2的失衡密切相关。STZ是一种含亚硝基化合物,能特异性破坏胰岛β细胞,机制之一是通过诱导NO的合成增加对胰岛β细胞的氧化侵袭,与IDDM病人发病时体内氧化侵袭增加相类似。小剂量STZ注射破坏少量胰岛细胞,死亡胰岛细胞作为抗原被巨噬细胞吞噬,产生TH1刺激因子(IL-12),使TH1细胞系占优势而产生IL-2及IFN-γ,在胰岛局部促使炎性细胞浸润,并活化释放IL-1β、TNF-α、IFN-γ及氧自由基NO、H2O2、O2,杀伤少量细胞,死亡细胞再次以自身抗原释放,并再次递呈给APC细胞进行处理。释放细胞因子,放大细胞损伤效应,最终导致IDDM。.由于正常机体免疫系统存在自我调控机制,仅进行一次小剂量STZ注射引发的自身免疫反应很快就会被减弱或终止。从实验中可以观察到,仅注射一次小剂量STZ,有极少数大鼠发生尿糖阳性,说明自身免疫反应被阻断,未形成β细胞破坏、APC细胞处理抗原产生细胞因子、TH1细胞增殖、β细胞破坏的循环放大效应。因此只有通过多次小剂量STZ注射,不断强化自身免疫反应,破坏免疫抑制机制,最终导致稳定持久的IDDM。

  ⑵STZ并高糖高脂饮食诱导大鼠Ⅱ型糖尿病

  本实验性2型糖尿病模型建立的设计原理 2型糖尿病是一个复杂的群体,其发病总的来说可以归纳为胰岛素作用受损(胰岛素抵抗)及胰岛素分泌障碍两方面缺陷的存在。它可以是胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌障碍,也可以是胰岛素分泌障碍为主伴或不伴胰岛素抵抗。临床和流行病学研究表明,通常胰岛素抵抗是启动2型糖尿病发生的初始原因。胰岛素抵抗发生后,只要胰腺能维持足够高的胰岛素分泌量来克服胰岛素抵抗,那么,糖耐量将保持正常或只有轻度受损。一旦β细胞功能开始衰竭,糖耐量将迅速恶化,并发展为糖尿病。而已经知道,大量糖摄入和脂肪摄入会导致肌肉和脂肪组织胰岛素抵抗,大量脂肪摄入也引起内源性糖产生抑制受损。也就是说,高糖高脂饮食及肥胖在胰岛素抵抗的诱发及最终糖尿病的发病中可能起重要作用。

  通过注射同样剂量的STZ后,模型组发展为明显的高血糖症,而常规饮食组仅有轻微的变化。这也从另一方面说明,当机体存在胰岛素抵抗时,发展为2型糖尿病的危险性增大。已经知道,血糖的变化与STZ呈剂量依赖关系。以往的研究已经证实,25mg/kg的STZ虽然会引起胰腺部分破坏,并不足引起大鼠血糖升高,只有胰腺破坏超过40%时,才会导致高血糖症[10]。模型组血糖升高也说明,STZ注射前胰腺克服胰岛素抵抗的代偿能力已经到了极限。所以一旦胰岛素分泌量下降,就导致了糖尿病的发生。

  二.        蒺藜皂苷

  蒺藜(TribulusterrestrisL.)又称白蒺藜,刺蒺藜,系蒺藜科(zygophyllaceae)蒺藜属植物,具平肝解郁,活血祛风,祛痰止咳,明目,利尿,止痒之功效,临床用于治疗头痛,头晕,气管炎,目赤多泪,高血压,皮肤瘙痒和风疹等症,在治疗心脑血管性疾病方药的组方中应用颇多。最近,以蒺藜有效成分为主的制剂有心脑舒通,Tribestan,Vitanone和Tribusaponin等,在防治心脑血管疾病!抗衰老和治疗性功能减退症等方面均显示出良好疗效。

  1.     降糖作用

  正常雄性小鼠20只,随机分为正常对照组和给药组,给药组每天灌胃蒺藜皂苷水溶液150mg/kg,正常组每天ig等体积的生理盐水,连用14天,观察给药7天,14天后血清葡萄糖变化,同时观察给药期间小鼠饮水量和饮食量的变化。

  小鼠禁食6h,按180mg/kg ip4%Alloxan 溶液,72h尾静脉取血,测定禁食6h后小鼠的空腹血清葡萄糖含量,取血糖大于15mmol/kg者随机分为2组模型组,蒺藜皂苷组,每组8只,分别ig或等体积生理盐水,每天一次连续10天,10天时各组禁食6h,眼眶取血,按试剂盒测定血清葡萄糖,甘油三酯,胆固醇及SOD。

  结果可见:蒺藜皂苷具有降低正常小鼠,高血糖小鼠血清葡萄糖,Alloxan糖尿病小鼠血清胆固醇和甘油三酯水平的趋势。还具有增强小鼠血清SOD清除氧自由基及其代谢物的能力。

  2.     降糖机制

  研究显示,化学或免疫作用损伤胰岛B细胞可能引起2型糖尿糖(IDDM)。此损伤过程所产生的氧自由基在胰岛B细胞的杀伤中起着重要的作用。蒺藜因含有过氧化氢酶而具有抗氧化作用,能减轻胰岛B细胞的氧化损伤。

  在高血糖病理状态下,蒺藜水煎剂是通过刺激胰岛ß细胞分泌胰岛素,还是通过增加肝细胞中胰岛素的受体的数目和对胰岛素的亲和力来降低血糖和血脂及抑制糖异生,或者还有其他的降糖机制,还有待于深入研究。

  3.     其他作用

  ⑴升高血清睾酮含量

  服食蒺藜提取物可以升高血清睾酮含量,使血清睾酮含量相对于对照组升高了22.33%,且有显著性差异。睾酮在雄性激素中活性最高,在运动训练中对运动成绩的影响有着重要意义。在睾酮进入靶细胞后可与受体形成复合物,随后再转移至细胞核内与染色质作用引起有关基因开放,促进核酸合成,还可以刺激组织摄取氨基酸,进而引起蛋白质合成加强,睾酮还可减少蛋白质分解,提高机体酶的分子数及其活性,促进肌纤维生长;促使骨基质合成,有利于钙盐沉积,加快骨骼生长;可增加肾脏EPO的制造,故能刺激红细胞的生成;加强磷酸肌酸合成,增加糖原储备,维持雄性攻击意识,等等。

  有研究发现,生理水平的睾酮(内源或外源替代)可通过调节血脂和增强机体抗氧化能力,对调节血脂浓度和防止动脉粥样硬化是有益的。内、外源性的睾酮在提高机体抗氧化能力、减少MDA生成的途径上可能存在不同之处,因为内源性睾酮有升高血浆SOD的作用,而外源性睾酮替代并不提高SOD水平,反映外源性睾酮对SOD以外的抗氧化酶系存在调节作用。

  ⑵提高SOD活性

  蒺藜水煎剂能够提高衰老小鼠红细胞SOD活性,降低MDA含量,可有效地提高机体的抗氧化能力。

  ⑶抑制动脉粥样硬化

  脑康组的血清胆固醇(TC)和低密度脂蛋白 (LDL2C)明显降低,血小板聚集率,血浆粘度及纤维蛋白原显著降低,同时血浆TXB2(血栓烷B2)明显降低而前列环素PGF1a(62Keto2PGF1a)升高,病理学检查显示AS斑块明显减少。TXB2(血栓烷B2)具有强烈的促血小板聚集,血块形成和收缩动脉血管的作用,而PGF1a正相反。提示脑康能多途径干预AS的发生,发展和促进其消退。

  ⑷抗血栓作用

  给大白鼠灌胃JL21(蒺藜有效成分之一)150mg/k1h后,采血测定显示JL21可有效抑制ADP引起的大鼠血小板聚集和KCI引起的离体兔主动脉血管平滑肌收缩,抑制大鼠体外血栓形成,并改善高分子右旋糖酐所致兔球结膜微循环障碍。师勤等研究结果亦显示蒺藜水提物有明显抗血栓作用。

  ⑸改善周围微循环兔灌胃心脑舒通(蒺藜总皂苷制剂)100mg/kg,用药后血浆中cGMP和cAMP含量明显增加,导致血管舒张,血流量增加,并具有改善周围微循环和组织代谢的作用。

  ⑸抑制TNF

  GSTT可剂量依赖性地抑制TNF2a(肿瘤坏死因子2a)和IL21B(白细胞介素1B)的作用,降低E选择素的表达量,从而降低CMEC(牛脑微血管内皮细胞)与PMN(中性粒细胞)及MNC(粘附大鼠单核细胞)的粘附率,显示出对脑缺血再灌注损伤早期的保护作用。IL21B和TNF2A是机体免疫细胞分泌。

  ⑹增强机体免疫功能

  GSTT能使幼年小鼠胸腺和肝脏的重量明显增加呈现增强机体免疫功能的作用。

  ⑺ 强壮作用

  蒺藜提取物作为替换物使用能增进蛋白质的合成并维持氮的平衡,有益于肌肉生长和机体强壮。

  【参考文献】


  蜂胶在STZ所致大鼠Ⅱ型糖尿病模型中的降糖作用

    刘莉

 

  一.选题背景

    蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物的芽苞、树干等部位采集的树脂,经蜜蜂加入自身的分泌物,转化而成的胶状物。被誉为自然界的“紫色黄金”。 近代的澳洲学者吉萨伯提于1979年有系统地整理蜂胶的化学成分、生物活性和医学用途的研究报告。此后,各国研究者也陆续投入蜂胶的研究[1,2]。其中对蜂胶在降糖方面的研究上也有了广泛的涉猎。

    总结蜂胶对糖尿病的防治具有以下六大作用[3-5]:调节代谢(降低血糖、防治心脑血管病);免疫调节;抗病原微生物;增加生物酶活性、抗氧化;细胞新生;恢复体力。而蜂胶预防和治疗糖尿病的机理和途径主要有以下几方面[6-10] :1)蜂胶蜂胶中的黄酮类、萜烯类物质具有促进利用外源性葡萄糖合成肝糖原的作用;2)蜂胶有很好的杀菌消炎作用,可以恢复胰岛细胞功能;3)蜂胶能防止脂类的氧化;4)蜂胶有加强药效的作用,可用于辅助治疗;5)蜂胶中的黄酮类物质具有很好的保护心血管的作用;6)蜂胶中的黄酮类、甙类等物质可增强ATP活性;7)蜂胶中的黄酮类物质、多糖物质具有调节机体代谢,增强机体免疫能力的作用;8)蜂胶中丰富且均衡的各种微量元素对糖尿病的防治有特殊意义;9)蜂胶可调节与糖代谢有关酶系的释放及其活性,降低餐后血糖;10)蜂胶抑制AR、GA活性、抑制蛋白糖基化,从而对抗糖尿病;11)蜂胶使受损细胞再生,利于损伤修复;12)蜂胶可通过修复和清除调节机体各种神经系统紊乱。

  二.研究的目的与意义

    在以往的各项研究中有很多是以四氧嘧啶(alloxan)来复制糖尿病模型的,链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)和四氧嘧啶均可复制Ⅰ型糖尿病的动物模型,而相对于四氧嘧啶来说小剂量STZ在复制Ⅱ型糖尿病的动物模型上更具优越性[11],因其造模稳定,快速,种属选择性不强(豚鼠只能用STZ造模) ,复制前不需禁食,组织毒性相对较小等[12]。进期的报道表明联合应用STZ和四氧嘧啶复制糖尿病大鼠模型,成功率达82.6%,且成本低[13]。故也可考虑联合应用来造模。

    现已有许多关于蜂胶在降糖方面的研究,但很多只是对血糖的降低这项指标比较关注,在通过实验对蜂胶在对糖尿病治疗中的其他重要项目和指标及其意义暨降糖的多种机制的阐述还不够全面。故本实验希望根据实验中对血糖、糖耐量、多种氧自由基和细胞因子的测定及对实验动物处死前后动物体液、多种器官和组织的收集和检验来从多方面多角度说明蜂胶在糖尿病治疗中的多种机制。

  三.拟采用的技术路线

   1.复制动物模型

    方法一:小剂量多次注射STZ致Ⅱ型糖尿病模型,以40mg/kg体重的STZ左下富强注射,注射前用0.1mol/L无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(PH4.5)配制,每日上午注射1次,连续注射5次。造成胰岛β细胞轻度损伤,使多数动物产生糖耐量异常,在此基础上,给动物喂高热量饲料,10星期以后,动物可有肥胖,并伴有高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗。此模型形成率约为70%。胰岛素增敏剂显示阳性结果。

 方法二:8周龄的SD大鼠高热量喂养2个月后给予小剂量的STZ(15 mg/kg ,iv)可建立具有外周胰岛素抵抗和胰岛功能轻度受损的糖尿病动物模型,与人Ⅱ型糖尿病的发生、发展过程相似,且STZ 用量小,减少了对其他组织的损害[14]。

  机制:STZ通过自由基损伤β细胞,使β细胞功能受损,胰岛素合成减少,引发糖尿病[15]。同一种系中STZ致细胞损伤程度取决于STZ 的量,低剂量诱导β细胞INS-1调亡,高剂量致β细胞坏死[16]。一次性大剂量注射STZ(大鼠60~80 mg/kg ,iv或ip ,小鼠100~200 mg/kg ,iv或ip ,临用前溶于011 mol/ L 柠檬酸缓冲液中)可致β细胞坏死而无胰岛炎,制成无炎性Ⅰ型糖尿病模型。注射72 h 后,血糖可稳定升高,动物有三多症状( 多饮, 多食, 多尿)。预测血糖在11.1mmo l/ L以上即可选用。小鼠多次小剂量注射(40mg/kg ,连续5d)可引发胰岛炎,制成免疫Ⅰ型糖尿病模型,STZ 可能通过细胞介导的自身免疫反应起作用[17]。作用强度与性别有关,雄性鼠更敏感[18]。

  2.分组及治疗

    正常组:不造模,以蜂胶混悬液(9 ml/kg)给大鼠灌胃4周后断头处死(处死前10h禁食水,以下相同),10只;蜂胶高、中、低剂量组(15.0ml/kg、5.0 ml/kg、0.5 ml/kg[19]):从造模结束后次日开始,以蜂胶混悬液给大鼠灌胃4周后断头处死,每组个10只;模型组:于造模结束后次日将大鼠断头处死,10只。

  3.降糖作用

    1)空腹血糖测定:空腹尾静脉取血后用氧化酶法测血糖。观测蜂胶的降糖效果。

    2)葡萄糖耐量实验:腹腔注射糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT):大鼠禁食10h后,给予葡萄糖2g/kg体重腹腔注射,在设定的时间点将尾静脉割破取血,用氧化酶法测血糖。观测蜂胶在对糖尿病的治疗过程中是否对糖耐量有影响。

  4.处死前、后样品收集

    对实验动物处死前、后的血清、胰腺组织、肝脏、骨骼肌、脂肪、心肌进行收集。通过化验检测和病理观察检查蜂胶是否对胰腺的β细胞、肝组织、心血管系统和骨骼肌起到了保护和修复的作用,是否具有减少脂肪堆积和脂质沉积的作用。

  5.对氧自由基的影响

    1)血清中过氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量:订购SOD、MDA试剂盒检测各组(正常、模型、治疗高/中/低剂量等5组:共50个样品)样品血清中的含量。

    2)血清一氧化氮合酶(NOS)含量:订购NOS试剂盒检测各组(正常、模型、治疗高/中/低剂量等5组:共50个样品)样品血清中的含量。 检测蜂胶是否能增强SOD、 MDA和NOS的活性,清除自由基,防止脂质氧化,保护胰岛β细胞免受自由基攻击。

  6.对细胞因子的影响

    1)血清中白介素(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ)水平:订购IL-1β、TNF-α、INF-γ试剂盒检测各组(正常、模型、治疗高/中/低剂量等5组:共50个样品)样品血清中的含量。

    2)胰岛组织中白介素(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ)水平:订购IL-1β、TNF-α、INF-γ试剂盒检测各组(正常、模型、治疗高/中/低剂量等5组:共50个样品)样品血清中的含量。检测蜂胶是否能抑制血清中和组织中这些炎症因子的活性、生成或释放,达到抗炎、预防感染的作用。

  四.预期结果

    1.降糖:蜂胶可显著降低STZ所致Ⅱ型糖尿病模型大鼠的血糖值,对正常大鼠的血糖也有一定的降低作用。可增加糖耐量。

    2.器官和组织检查:对胰腺的β细胞、肝组织、心血管系统和骨骼肌起到了保护和修复的作用,可有新生的细胞,同时具有减少脂肪堆积和脂质沉积的作用。预期可减少多种糖尿病引起的心血管系统等的并发症。

    3.对氧自由基的影响:蜂胶可增强SOD、 MDA和NOS的活性,清除自由基,防止脂质氧化,保护胰岛β细胞免受自由基攻击,保证血液循环的畅通。

  4.对细胞因子的影响: 抑制血清中和组织中这些炎症因子的活性、生成或释放,预期可以达到抗炎、预防感染类并发症的作用。

 

  参考文献

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  19.蜂胶的生物学作用和药理研究.e康图书馆.http://www.chinahealth.com.cn/lib


  黄连素治疗2型糖尿病实验研究开题报告

 

  1.简介中药治疗2型糖尿病

  糖尿病(DM)是一组由遗传和环境因素相互作用,导致胰岛素分泌的绝对和相对不足以及细胞对胰岛素敏感性下降,而引起糖、脂肪、蛋白质、水、电解质等一系列代谢紊乱的临床综合征,以高血糖为主要标志。从实验和临床研究结果来看,中药具备多靶点、多层次综合治疗作用和功能调节作用,对糖尿病的治疗不仅能降低血糖,而且能有效地阻止和延缓糖尿病合并症的发生和发展,其作用温和持久、副作用较小或无副作用。

  中药降糖作用的药理学机制:

  1 促进胰岛素分泌,增加血清胰岛素的含量

  1.1 直接刺激胰岛β细胞分泌胰岛素    胡芦巴乙醇提取物4-羟基异亮氨酸

  1.2 通过保护、修复胰岛β细胞而增加血清胰岛素的含量

    生地黄连水煎液可明显降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖值,增加血清胰岛素的含量。光镜下观察模型组小鼠胰岛素内分泌细胞明显肿胀,胞浆减少,细胞排列稀疏,紊乱不均,见大小不等的空泡变性,核大小不等;而生地黄连大剂量组小鼠的胰岛内分泌细胞形态结构基本接近正常,肿胀减少,空泡变性减少,分泌细胞较模型组增加,提示其主要通过保护、修复胰岛内分泌细胞而增加血清胰岛素浓度[2]。

  1.3 防止胰岛β细胞的凋亡,促进胰岛素分泌     消渴停

  1.4 降低胰升糖素,增加血清胰岛素含量      糖渴清

  2 增加胰岛素的敏感性,改善胰岛素抵抗,降低血糖

  2.1 增加胰岛素受体数目及胰岛素与受体的结合力来提高胰岛素的敏感性

  三消治(人参、黄芪、生地黄、茯苓等)

  2.2 影响胰岛素受体后信号传导,增加胰岛素敏感性    桃核承气汤

  2.3 通过骨胳肌纤维组成成分的变化来增加胰岛素的敏感性     参地降糖颗粒

  2.4 通过增加靶组织葡萄糖转运体4(glucose transporter four GLUT4)的含量来增加胰岛素的敏感性    山茱萸乙醇提取液

  3 促进外周组织和靶器官对糖的利用    菊苣胶囊

  4 通过延缓肠道对葡萄糖的吸收而降低血糖    五味子、虎杖

  此外中药还可改善糖尿病并发症起到降血脂,改善血液流变性,清除自由基,抗脂质过氧化AGE抑制剂,醛糖还原酶抑制剂,蛋白非酶糖化抑制作用,改善血管的舒张功能,抑制内皮素的分泌等作用。

 

  2.简介黄连素治疗2型糖尿病的研究历史

  陈其明等以正常小鼠、四氧嘧啶糖尿病小鼠和自发性糖尿病KK小鼠为模型观察了黄连及小檗碱的降血糖作用,结果发现小檗碱可以降低正常小鼠、四氧嘧啶糖尿病小鼠和自发性糖尿病KK小鼠的血糖。在40mg/kg时已能显著降低正常小鼠血糖,这个剂量约相当于其半数致死量的1/10.,并呈明显的量效关系;且作用时间长达5h-6h,可以认为小檗碱的降血糖作用较强,持续时间也较长。就降血糖作用而言,其兼有磺酰脲类和双胍类化合物的特点。同时,小檗碱可以改善kk小鼠的葡萄糖耐量。宋菊敏等发现黄连素能明显改善非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)大鼠的血清胰岛素水平及30min,60min,120min的血糖水平,表明该药不仅能明显降低高胰岛素血症,改善病鼠的糖耐量异常及多种脂类代谢障碍的指标,而且能降低肝脏过氧化脂质,提高肝脏超氧化物歧化酶的活性,具有抗氧化作用。倪艳霞等研究发现黄连素对实验性糖尿病动物有显著降糖效果(P<0.01),停药1周以上仍维持疗效,与临床观察结果一致。

  3.介绍2型糖尿病造模方法(STZ)

  糖尿病(diabetes mellilus, DM)是一种慢性进行性内分泌代谢性疾病。为了弄清该病病因,尽快筛选出有效药物,需要一种成本低,复制成功率较高的DM模型。在实验研究中,复制DM模型比较普遍使用的是化学性损伤法,其毒性制剂包括:STZ、alloxan、二苯硫代卡巴腙(diphenylthiocarbazine)、喔星-9-羟基喹喏酮(oxine-9-hydroxyquinolone),vacor)。其中,二苯硫代卡巴腙、喔星-9-羟基喹喏酮及vacor 3类药物,复制率只有40%左右,故使用较少,而最常用的是STZ和alloxan两类试剂.

  联合应用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)和四氧嘧啶(alloxan)复制DM大鼠模型.减少了每种试剂的剂量,降低了毒性,增加了动物模型的成功率,同时,因STZ用量的减少而降低了成本。g/kg)方法,一次静脉注射,即减少了每种试剂的剂量,且对其它组织(如肝、肾)的损伤也较轻。

  链脲菌素(STZ) STZ对一定种属动物胰岛β细胞有选择性破坏作用,故可使许多动物产生糖尿病。由于其对组织毒性相对较小,动物存活率高,所以是目前国内外使用较多的一种制备糖尿病动物模型的方法。

  国内谢氏以小剂量STZ(25~30mg/kg)给雌性大鼠静脉注射,造成胰岛β细胞轻度损伤,其中约60%~80%的动物产生糖耐量异常,在此基础上加喂高热量食物引起动物肥胖而制得Ⅱ型糖尿病动物模型,该动物有胰岛素抵抗及高胰岛素血症。

  STZ造模方法:

  禁食12 h,按65 mg/kg体重单剂量腹腔注射,48~72 h后尾静脉采血,全血血糖≥16.7 mmol/L,尿糖3+~4+,维持1周以上确定为糖尿病模型建立.

  糖尿病大鼠模型(I型),STZ用量是65mg/kg体重,腹腔注射。注射前用0.1mmol/L,Ph值为4.2的枸橼酸缓冲液配制,要现用现配,粉剂STZ要在-20℃保存,称量时戴手套。成模率很高约为95%以上,成模率与大鼠的性别、年龄有关,选取雄性、体重在250--300g 的最好,给药48h后即可成模。

  I型:SIGMA streptozotocin 55mg/kg, i.p. 一次给药。>11mM

  II型:SIGMA streptozotocin 35mg/kg, i.p.,一次给药。>11mM,附加高脂高蛋白饲料。

  四氧嘧啶造模的成模率低,血糖容易恢复。如果用可以用150/kg腹腔注射,不过两周后一定复查血糖,有恢复的。

  用STZ比较稳定,剂量可以用50-60mg/kg腹腔注射,尾静脉剂量可以30mg/kg。

  4.设计实验

  实验目的:研究黄连素对实验性2型糖尿病小鼠模型脂类代谢,胰岛素抵抗,高血糖症的治疗作用

  实验动物:雄性小鼠50只

  实验药品:STZ,黄连素,高脂饲料,生理盐水

  观察项目:空腹血糖值,血中胰岛素含量,TC,TG,LDL-C,HDL-C

  实验步骤:制造2型糖尿病小鼠模型20只,分成治疗组与空白对照组,同时另取10只设立正常对照组。治疗组每天用黄连素溶液(100mg/kg)灌胃1次,空白对照组及正常对照组在相同时间灌服相同容积生理盐水,疗程30d治疗结束取血测血脂及血胰岛素。

   动物模型的建立及分组

  按照王彤等采用链脲佐菌素和高脂肪饲料诱导的实验性2型糖尿病小鼠模型的方法造模。正常雄性小鼠50只,体重20-30g(由山东省潍坊医学院动物实验中心提供)。高脂肪饲料喂养21d,第21天末禁食12h后,腹腔内一次性STZ(100mg/kg,0.1mol/l无菌柠檬酸缓冲液pH4.4配制,0.2mm微孔过滤灭菌),继续养28d后,称体重,禁食12h,取尾静脉血测空腹血糖(美国强生公司血糖仪和血糖试纸条测定),记录摄食量、饮水量,挑选具有多饮、多食、超重、血糖增高的小鼠确定为实验性小鼠,共20只。随机分为2组,治疗组10只,空白对照组(2-DM组)10只,另取10只正常小鼠作为对照组。

  给药方法及观察指标

  各组均改以基础饲料喂养,治疗组每天用黄连素( 青岛国风制药有限公司生产)溶液(100mg/kg),于09:00时灌胃1次,空白对照组及正常对照组于相同时间灌服相同容积的生理盐水,30d为1疗程,实验期间自由进水。治疗结束后禁食12h处死小鼠,摘眼球取血,测血TC,TG,LDL-C,HDL-C,血胰岛素。 

  标本测定

  TC,TG,LDL-C,HDL-C的测定采用日本生产HITACHI7170S:型自动分析仪,试剂购自北京利德曼生化技术有限公司。 

  统计学处理    采用方差分析,利用SAS统计软件包进行统计学处理。 

  预计结果:治疗组血TC,TG,LDL-C较空白对照组明显降低,血较空白对照组明显升高。

  预计结论:黄连素能明显改善实验性2型糖尿病小鼠的脂代谢异常.

  参考文献:

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  黄连素的临床应用及在治疗2型糖尿病方面的研究 

  [摘要] 本文综合论述了黄连素在心血管系统疾病,消化道溃疡,抗菌抗病毒,抗肿瘤,循环系统,免疫系统方面疾病治疗上的应用及其作用机制。并详细介绍了黄连素在治疗2型糖尿病及其并发症方面的作用机制及特点,发展方向。 

  [关键词] 黄连素   2型糖尿病   临床应用 

  1.黄连素的来源,提取,生化特性

  黄连素学名小檗碱,是生物碱的一种。它主要存在于黄柏、三棵针和黄连中。黄连分“味连”“雅连”和“云连”但总称黄连。黄连素为黄色,味极苦, 是抑制痢疾杆菌、链球菌及葡萄球菌的抗菌和消炎药。临床常作为清热解毒、抗肠道细菌感染类药物应用。近年来陆续发现其还有抗心律失常、改善充血性心力衰竭、降血糖、降血脂、抗小血板等药理作用,从而被广泛地应用于心律失常、心力衰竭、糖尿病、高脂血症等的治疗。

  小檗碱苦寒,人心、肝、胃、大肠经,主要功效泻火、燥湿,解毒、杀虫。主要功效益肺阴,清虚火,生津止渴。

  盐酸小檗碱

  化学名  5,6-二氢-9,10-二甲氧苯基[g]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯[5,6-α]喹嗪氯化二水合物

  英文名  BERBERINE HYDROCHLORIDE  

  分子式  C20H18ClNO4·2H2O

  分子量  407。85 

  2.黄连素临床应用及其机制

  心血管系统:

  心律失常:黄连素可以延长心肌细胞的动作电位时间和有效不应期,轻度降低0位相上升的速率,这可使单向阻滞变为双向阻滞或破坏折返环所需时程,从而消除折返性心律失常。黄连素能增加乙酰胆碱作用,乙酰胆碱可增加膜的钾电导,而使细胞内钾的外流增加,而起到抗心律失常作用[1]。

  心力衰竭::黄连素主要使心肌细胞动作电位时程和平台期延长,使Ca2+ 内流增加,从而起到正性肌力的作用。但由于黄连素静脉给药毒性大,甚至有人死亡,故有人提出不宜使用。另外黄连素不能取代传统的抗心力衰竭用药,对危重病例和运用黄连素效果不佳者,宜及时加用或换用强心、利尿、扩血管等治疗[1]。

  室性早搏:黄连素抗心律失常的作用机理尚未完全明了,动物细胞电生理学实验显示,黄连素可使豚鼠心室肌动电位时程增宽(以2相为主),有效不应期延长。黄连素分别延长心房、心室ERP和功能不应期,而对心房、心室相对不应期无影响。延长心肌APD及ERP,增加ERP/APD比值,有利于打断折返环和使之不易形成,这可能是黄连素抗心律失常的主要机制。其细胞水平的作用机制,可能与促进钙(Ca )跨膜内流有关。此外,研究还发现黄连素对血小板和血管平滑肌的a受体的抑制作用也有助于室性心律失常的控制[2]

  高血压病:有人认为黄连素对a1,a2受体具有不同程度亲和力,从而阻滞了a受体,扩张外周血管,使血压下降;也有人认为小剂量黄连素能抗胆碱酯酶,而增加乙酰胆碱作用,扩张血管,使血压下降;另外,以药理学的方法检测黄连素片对钙离子通道的拮抗作用,发现黄连素明抑制钙离子的内流,拮抗L型钙离子通道促进剂对钙通道的激活,而起到对钙离子通道的抑制作用[1]。

  高血小板聚集率患者:黄连素对血小板聚集具有明显的抑制作用,能改善微循环,恢复缺血区血流灌注[1]。

  高血脂症:实验表明,黄连素能明显地增强肝脏氧化歧化酶的活性,降低肝脏过氧化脂质水平及血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇含量,提高机体抗氧化能力,促进脂类的分解代谢,从而起到治疗和预防动脉粥样硬化的作用[1]。

  梗塞性疾病

  肿瘤:有报道黄连素能抑制肿瘤细胞DNA、RNA、蛋白质和脂肪合成的作用,还抑制葡萄糖氧化成co2,且葡萄糖有对抗肿瘤细胞摄取黄连素的作用,而增强黄连素的抗肿瘤作用[1]。

  台卫平[3,5]采用细胞培养的方法,将黄连素加入到结肠癌细胞培养环境中,观察

  CoX:在mRNA和蛋白质水平上的改变,及检测前列腺素(PG)E:的含量以观察C0X:活性,同时观察黄连素对结肠癌细胞的生长、增殖的影响。结果显示,黄连素在浓度大于0.3pmol/I时,对HT 29细胞的COX。在mRNA和蛋白质水平均表现为抑制,亦可抑制COX:的催化活性,抑制PGE 的生成。因此推论黄连素可能通过抑制细胞内Ca2+ 进而抑制COX:mRNA水平和蛋白质表达以及COX。对花生四烯酸的催化活性,从而抑制PGE 的生成,这可能为其抗消化道肿瘤的机制之一。

  抗菌及消化性溃疡:复发性口疮,溃疡性结肠炎,胃炎,,小儿感染性腹泻,小儿疖肿,小儿痄腮,小儿瘁疮,小儿脓疱疮,婴儿湿疹,褥疮,慢性胆囊炎,子宫糜烂,抗病毒[1,2]。

  糖尿病:观察血糖下降而血清胰岛素水平上升,考虑其具有抗升糖激素的作用,并可促进胰岛B细胞再生及功能恢复,小檗碱又有抑制糖异生和促进糖酵解的作用,使血糖下降。因本药同时有降压、降脂、抗感染作用,故对于预防糖尿病并发症也有意义[1]。

  抑制醛糖还原酶活性,防治糖尿病并发症:研究发现多元醇通路的关键限速酶一一醛糖还原酶活性升高是糖尿病神经病变和糖尿病肾病等并发症发生、发展的重要原因。刘长山等观察黄连素对糖尿病患者醛糖还原酶活性抑制作用及对糖尿病神经病变多项指标的影响,结果显示黄连素治疗组治疗后醛糖还原酶活性受到抑制,运动、感觉神经传导速度的改善明显高于对照组,膀胱残余尿量亦显著少于对照组[2]。

  对环孢素A的增效减毒作用[2]

  免疫调节作用:黄连素对免疫系统的影响较为复杂,既有作用性质上的差异,也有剂量效应的异同,总的效应是增强单核吞噬细胞系统功能,抑制细胞和体液免疫功能[2]。

  黄连素与骨质疏松:骨质疏松是骨密度下降所致,黄连素具有抑制破骨样多核细胞的形成及重吸收作用,阻止腰椎中骨矿物质密度的下降,进而发挥出治疗骨质疏松的功效。

  防治老年痴呆  

  3.黄连素治疗2型糖尿病研究

  A单味用药:,

  黄连素治疗糖尿病的可能机制:

  黄连素治疗糖尿病作用肯定,对其机制的研究也在不断深入。目前的实验表明黄连素治疗糖尿病的机制可能有以下几方面[4].

  1.黄连素未影响胰岛素的分泌与释放,也未影响肝细胞膜胰岛素受体的数目和亲和力,其作用可能为受体后效应;它可对抗注射葡萄糖引起的血糖升高,抑制以丙氨酸为底物的糖异生,它的降血糖作用与血乳酸升高密切相关,因而可能通过抑制糖异生和0 或促进糖酵解产生降血糖作用;

  2.黄连素能降低高胰岛素血症,增加胰岛素的生物活性,减轻糖耐量损伤,促进脂类分解代谢,提高机体抗氧化能力;

  3.激素黄连素具有抗升糖作用,并能促进胰岛$细胞再生及功能恢复;

  4.黄连素有与二甲双胍相似的增加胰岛素敏感性作用通过保护、修复胰岛β细胞而增加血清胰岛素的含量。

  生地黄连水煎液可明显降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖值,增加血清胰岛素的含量。光镜下观察模型组小鼠胰岛素内分泌细胞明显肿胀,胞浆减少,细胞排列稀疏,紊乱不均,见大小不等的空泡变性,核大小不等;而生地黄连大剂量组小鼠的胰岛内分泌细胞形态结构基本接近正常,肿胀减少,空泡变性减少,分泌细胞较模型组增加,提示其主要通过保护、修复胰岛内分泌细胞而增加血清胰岛素浓度[6]。  

  黄连生物碱治疗糖尿病潜在的分子靶点[7]:

   葡萄糖代谢:一些研究表明,黄连生物碱对于影响细胞糖消耗有着类似于胰岛素的直接作用。殷峻等观察了小璧碱对HepG2细胞作用,结果提示小粟碱的降糖作用部分是通过增加肝细胞的葡萄糖消耗量来实现的,与二甲双肌类似,是不依赖于胰岛素的独立作用结果。小梁碱不但可以增加脂肪细胞的葡萄糖消耗量,还用动态的方法观测脂肪细胞对于外源葡萄糖的转运能力,发现其在小聚碱的作用下有明显提高。陈其明等观察到小巢碱对正常动物和四氧喃吮糖尿病动物都有明显降血糖作用,认为其兼有磺酞脉类和双肌类化合物特点。小聚碱还可以提高大鼠的肝糖原含量川。细胞 对 葡萄糖的消耗增加,这是一个表象,可以将其视为葡萄糖代谢增加和糖原分解释放减少净作用的结果。其中涉及到很多环节分子水平的变化,这些生物大分子都有可能成为黄连生物碱作用的靶点。归纳起来,比较重要的生物大分子有以下几个: (1 )葡萄糖运载体(GLUT)是肌肉、脂肪等胰岛素敏感组织细胞膜上的特异性从胞外向胞内转运葡萄糖的蛋白,这种蛋白在细胞膜上数量的多少,以及是否能在受到外界刺激(例如胰岛素的作用)时被充分激活从胞浆移位到细胞膜上参与葡萄搪的转运,直接影响细胞对于葡萄糖的摄取,可以说是细胞消耗葡萄糖的第一个关卡。(2)葡萄糖酵解和Krebs循环中各代谢步骤中的酶:酵解和Krebs循环是使葡萄糖最终氧化变成水和二氧化碳并产生能量物质(ATP)的重要生物化学过程。涉及的酶很多,但其中有几个限速酶影响到整个反应链的速度,例如:位于胞浆中的己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶以及线粒体中的柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶等。(3)肝糖原分解过程中的酶,如果能抑制分解酶的活性,就有助于减少肝糖向血液的输出从而降低血糖。而糖原分解的第一个步骤就是由糖原磷酸化酶催化的,因此这个酶就成为一个重要的药物作用研究靶点。(4)一些能感受细胞能量缺乏的蛋白激酶,如AMPK,此酶可以在运动时增加骨骼肌对葡萄糖的摄取,并且在能量缺乏时增加氧化产能的反应。

  脂质代谢:一些针对小聚碱或含小粟碱中药复方的药效研究都观察到了小粟碱有助于改善糖尿病大鼠模型或病人的脂质代谢紊乱,降低血清胆固醇、甘油三醋的含量,并预测可能对于防止心血管的并发症有帮助。另外的研究闭则只观察到了小粟碱的轻微地、不明显地改善脂质代谢的现象。但还有几则临床应用小粟碱给予糖尿病人降脂治疗的短篇报道则给出了较为肯定的结论。

  脂质代谢紊乱对机体影响很大,甚至是造成糖尿病人胰岛素抵抗的直接原因。现在已经明确发现,循环系统中游离脂肪酸(FFA)浓度增加就足以导致肝组织的胰岛素抵抗,肌肉组织中甘油三酷的堆积也可以导致该组织的胰岛素抵抗,如果胰岛日细胞中甘油三醋过多则会损害其分泌胰岛素的功能[15]在影 响 脂 质代谢的大分子中,比较重要的有:合成代谢转录因子SREBP-1,此因子可以使产生脂肪合成酶系的相关基因表达增加;受AMP激活的蛋白激酶(AMPK ),这种酶在细胞内部能量缺乏时被激活,使下游的酶磷酸化,从而增加脂肪氧化减少脂肪合成,而且还能对SREBP-1起到抑制作用;乙酞COA梭化酶(ACC),它就是一个AMPK的底物,被磷酸化后失活,从而使脂肪合成停止。

  炎症因子:一些炎症因子对于胰岛素抵抗的发生起着重要的作用,从起初的肿瘤坏死因子(TNF-a )和白介素一6(IL-6),到后来的脂联素、抵抗素等。在肥胖者的脂肪组织细胞中TNF-a的表达水平明显增高且与胰岛素水平呈正相关,如果体重下降,其表达水平亦随之减少;TNF-a能调控很多脂肪细胞分泌的细胞因子,从而作用于脂肪的摄取和代谢。TNF-a的净效应是增加脂解,减少脂肪的合成,增加了FFA向循环系统的释放,同时它还能抑制GLUT蛋白的基因表达,下调细胞内GLUT的含量,以及削弱胰岛素信号传导通路。总之,TNF-a是引起胰岛素抵抗的重要因素。同样 ,在 肥胖者的脂肪组织中IL-6的含量也增加,其增加肝细胞甘油三醋的输出,减少脂蛋白脂肪酶(LPI)的含量,增加FFA的输出,导致胰岛素抵抗C 反 应 蛋白(CRP)是由肝细胞合成的一种非特异性的炎症因子,是急性时相反应的标志物。而急性时相反应与五型糖尿病及其大血管、微血管并发症有着直接的关系。很多证据表明,CRP已经成为I型糖尿病发病的重要预测因子。由于脂肪细胞分泌的TNF-a和IL-6是刺激肝脏合成CRP的主要因素,因此检测血清CRP水平可以成为衡量TNF-a和IL-6浓度高低的一个间接的方法。

  目前 尚 未 见 到直接研究黄连生物碱作用于炎症因子报道。但有人在研究黄连及小聚碱抗炎症机制的时候探讨过其对IL-1和TNF的影响。郝任等发现小聚碱能抑制IL-1和TNF激活的内皮细胞与多形核白细胞(PMN)的勃附,拮抗这2种细胞因子的作用,并能下调由IL-1和TNF诱导的HUVEC表面ICAM-1分子的高表达,同时可以减少TNF诱导的PMN CD18表达增多。王利津等也发现黄连解毒汤(黄连、黄荃、黄柏、桅子)对IL-1的生成有抑制作用。

  抗氧化、清除自由基:细胞代谢中时刻存在着氧化反应,产生大量的自由基,适当浓度的自由基对于激发细胞功能,抵抗细菌、病毒的攻击,有着重要的意义。但一旦细胞中的某些清除自由基的功能发生了障碍,过多聚集的自由基就会攻击细胞内蛋白、膜脂、核酸等重要生命活动所需的分子,造成细胞功能的障碍,严重时可以引起细胞的凋亡。I型糖尿病后期出现的胰岛素分泌绝对不足,向I型糖尿病转变的过程,很大程度上要归因于胰岛R细胞的凋亡。现 在 有 证据表明,增高的FFA对于月细胞会产生毒性,而一些细胞因子如IL-1,T NF-a,IF N-Y也促使月细胞的凋亡。共同的作用机制诱导了一氧化氮合酶(NOS)的产生,从而合成了大量的自由基分子NO,而NO会损害日细胞的DNA,并通过还尚不明确的机制,使细胞凋亡。此外,I型糖尿病人胰岛R细胞持续地分泌胰岛素需要线粒体旺盛的氧化磷酸化过程产生ATP,同时也产生了大量的活性氧自由基[24]。这些自由基如果得不到清除,则会逐渐损伤线粒体,同时还可以进一步诱导归细胞的凋亡。很多 研 究都发现了小聚碱有抗氧化、清除自由基的功能。黄连解毒汤对红细胞的自氧化和H2O:所致的氧化均有显著的抑制作用,并有一定的清除经基自由基的活性。金昔陆等发现小粟碱结构类似物能抑制脂质过氧化和清除经基自由基。Naoko等认为小粟碱对于地塞米松诱导的鼠胸腺细胞的凋亡有抑制作用。席刚明等发现小聚碱可以增加小鼠全脑缺血后海马CA:区bcl-2基因的表达,降低Bax基因的表达,从而减少凋亡的发生。小聚碱可以减少脂质过氧化物生成,提高谷胧甘肤(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。何浩等[5]观察到了小璧胺能参与清除活性氧自由基并保护SOD,CAT及GSH-Px等清除自由基的酶类,使它们的活性维持更长的时间。孙翠梅等在研究同属黄连生物碱的巴马汀的药理作用时发现它可以降低脑缺血组织中NO的含量,从而保护缺血组织。

  细胞K+离子通道和细胞内Ca2+ 浓度:胰岛p细胞分泌胰岛素的机制与其细胞膜上的K十通道和细胞内Ca'+浓度的变化有着密切的关系。当R细胞外葡萄糖浓度升高时,就通过p细胞膜上葡萄糖运载体2(GLUT2)向细胞内转运并通过糖酵解和Krebs循环过程产生ATP。升高的ATP浓度则特异性地关闭ATP依赖型的K+通道,从而引起日细胞膜的去极化,继而引起细胞外Ca'+的流人和细胞内源性Ca2+ 的释放。细胞内Ca'+浓度的上升就可以使含有胰岛素的分泌囊泡从内质网向细胞膜转移并将胰岛素释放到胞外。磺酞脉类降糖药物就是通过作用于胰岛R细胞膜K+通道上的磺酞脉受体(SUR1),引起K+通道的关闭而起到促进胰岛素分泌的药理作用的。目前,一些研究表明小聚碱能够阻断心肌细胞对ATP敏感的K+通道,其结构类似物也是一种肝细胞K+通道的阻断剂。但是有报道表明小粟碱未能增加正常小鼠的胰岛素分泌,也不增加给葡萄糖负荷后的胰岛素释放。所以,小聚碱是否同样能作用于p细胞的与胰岛素分泌密切相关的K十通道,效果是否也是其阻滞剂,仍是一个未知的课题。此外,有研究观察到小粟碱有减少平滑肌细胞内Ca2+浓度的作用,假设他们也作用于胰岛p细胞,降低胞浆中的Ca'+浓度的话,则会对胰岛素的分泌产生抑制作用。澄清这些问题有助于更好地阐明胰岛细胞是否是黄连生物碱作用的靶点之一。

  胰岛素对糖尿病并发症及合并症的治疗:

  糖尿病肾病

  刘长山[8]等利用糖尿病SD 大鼠动物模型观察了中药黄芩甙、黄连素及典型的醛糖还原酶抑制剂sorbinil 对大鼠组织醛糖还原酶(AR)的活性和肾脏病变的影响,结果发现糖尿病鼠经上述3种药物治疗后,其晶体、肾脏AR活性明显下降,尿蛋白呈明显下降趋势,肾小球病理变化得到明显改善,提示中药黄芩甙、黄连素对逆转糖尿病肾脏病变疗效显著,有望为糖尿病肾脏病变的防治提供一条新途径。

  糖尿病神经病变

  刘长山[11]等的研究表明黄连素对醛糖还原酶的抑制作用较强,可明显改善糖尿病鼠的坐骨神经传导速度,且与sorbinil相当18。在糖尿病神经病变防治方面,黄连素不失为一有效药物。

  糖尿病性腹泻

  袁健等报道黄连素能明显延长小肠传递时间,延长滞留时间有利于物质吸收,故对糖尿病自主神经病变所致的腹泻有很好的疗效。

  糖尿病合并心脑血管疾病

  张继英[12]等研究证实,大剂量黄连素能明显改善糖尿病病人的血液流变学,在降低血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞压积、纤维蛋白原及血糖等方面优于川芎嗪。黄伟民[13]等还观察了黄连素对ADP 及肾上腺素诱导正常人及血小板聚集率增高病人血小板聚集的体外影响,证明均有抑制作用,与应用潘生丁合并阿司匹林有几乎相同疗效。体外实验还证明黄连素能显著抑制富含血小板血浆凝块收缩的作用。糖尿病病人常见血小板的黏着和聚集性增高,导致凝血异常,从而导致心脑血管血栓事件的发生,黄连素的上述作用对预防和治疗糖尿病合并心脑血管疾病具有重要价值。

  糖尿病合并高脂血症

  已有实验[17]证明小檗碱能够降低喂高胆固醇乳剂小鼠的血清胆固醇水平,并纠正NIDDM大鼠脂肪代谢紊乱。孙杰[14]选择一组老年高脂血症病人进行临床观察,在低脂饮食1月以上加黄连素片.0.3~0.4g,每日3次口服,不使用其他降脂药,结果发现降胆固醇、三酰甘油的总有效率均为100%。糖尿病合并高脂血症已众所周知,且降脂药均有一定的副作用,黄连素副作用少,耐受性好,是一种安全有效的降脂药物。

  B联合用药:

  优降糖联合黄连素:

  黄连素+优降糖1.25mg与单一降糖药优降糖治疗糖尿病比较,疗效明显优于单一降糖药,且血糖下降的时间、水平、稳定性均比单一降糖药具有明显优越性。

  卡托普利联合维生素E黄连素:

  卡托普利属于血管紧张素转换酶抑制剂(ACED,研究证明ACEI能明显降低肾组织局部Ang I水平,降低肾小球毛细血管内压、减少尿蛋白的排泄,抑制TGF日的产生,减轻ECM的积聚而改善肾脏功能。现代中药研究黄连素体内外均可抑制AR活性,使糖代谢多元醇通路受到抑制,间接阻断了TCF日,减轻了对肾脏的损害。此外维生素E有明显的抗氧化作用,抑制了微血管内皮细胞二酞基甘油(DAG)的合成,阻断了二酞基甘油一蛋白激酶C (DAG-PKC)的异常通路,减少了细胞和微血管的损害。另一方面维生素E抑制氧自由基的产生,亦可防止血管内皮细胞的损伤。因此本组选用上述三药联用治疗DN起到了较为理想的效果[15,16]。

  中药——蜂胶,玉泉丸,六味地黄丸等

  降糖散(黄连素0.5g,人参0.5g,构祀子5g,黄精4g,黄茂5创)

  四参三黄二虫饮(红参、沙参各12g,丹参、生地黄芡各12g,元参12g,黄精20g,蚂蚁粉、僵蚕粉各4g,黄连素0.5g)

  4.展望:

  药效,机制,药量,副作用,不良反应,联合用药

  黄连素作为抗生素已有较长的应用历史,临床无明显副作用。黄连素作为降糖药亦有十余年的应用史,除极少数患者有长期应用而见便秘症状外,菌群失调、急性心源性脑缺氧综合征;过敏性休克;麻疹样药疹和尊麻疹样药疹;血色素白细胞减少;肠道刺激;头晕耳鸣等症发生率极低。且黄连素有降脂、醛糖还原酶抑制剂等作用,对糖尿病及糖尿病并发症如高血压、冠心病、动脉硬化、高脂血症、周围神经病变应能起到一药多用的作用,对糖尿病合并有胃肠疾病如慢性胃炎、溃疡病、结肠炎等的治疗,有较好的辅助治疗作用,且黄连素价格低廉,易于推广。亦有当黄连素达到降糖剂量后,在加大剂量亦不引起低血糖的报道,因此在临床应用中较安全临床应 用 黄连素以及其他降糖药一样,有一定的适应症,对糖尿病兼见舌红、口干、口渴、皮肤疖肿、膀胧炎、神经炎等炎性病变者,效果会更好。

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  蜂胶在糖尿病治疗中的作用及其机制的研究进展
  刘莉(26020513)

 

  [摘要]蜂胶作为一种天然的珍贵物质,由于其内含丰富的营养成分,且具有强大的治疗和保健的作用,已逐渐被全世界所重视,各国研究者也陆续投入蜂胶的研究,蜂胶的多种生物学作用相继被开发,使蜂胶迅速成为保健品,尤其是蜂产品保健中研究与开发的热门。其中,对蜂胶在糖尿病的防治方面更是研究深入、迅速、备受瞩目。本文就蜂胶在糖尿病治疗中的作用及其机制的研究进展做以综述。

  [关键词] 蜂胶、糖尿病 

  1 蜂胶的成分与功效

  蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物的芽苞、树干等部位采集的树脂,经蜜蜂加入自身的分泌物,转化而成的胶状物。是一种集动植物精华为一体的纯天然复方物质,呈粘稠状态,颜色一般为暗茶褐色。因其产量有限,被誉为自然界的“紫色黄金”。近代的澳洲学者吉萨伯提于1979年有系统地整理蜂胶的化学成分、生物活性和医学用途的研究报告。此后,各国研究者也陆续投入蜂胶的研究,蜂胶的多种生物学作用相继被开发[1,2]。

  蜂胶含有300多种,20余类天然成份。其中包括三十多种人体必需的微量元素、二十多种氨基酸、数十种芳香化合物、三十多种黄酮类物质,还有丰富的有机酸、萜烯类物质、维生素、酶类、多糖等具有生物学和药理学活性的天然成份。

  蜂胶具有非常广泛的医疗和保健作用。可归纳为如下八个方面[3]:抗病原微生物;镇静、麻醉及其它神经系统作用;促进组织修复;心脑血管系统的影响;保肝作用;抗肿瘤作用;清除自由基、促进新陈代谢、调节内分泌、调节免疫;无毒副作用。

  2 蜂胶在糖尿病治疗中的作用

  总结蜂胶对糖尿病的防治具有以下六大作用[4-6]:

  1)调节代谢

  蜂胶对糖、脂类、蛋白质等物质的代谢均有调节作用,消除各物质不平衡状态,使机体得到综合的平衡的治理,创造和提供防治糖尿病的基础和条件。具体可表现为:

  第一,帮助降低血糖。有实验表明用蜂胶复合软胶囊内容物分别给糖尿病大鼠及正常大鼠灌胃,可显著降低四氧嘧啶所致糖尿病大鼠的血糖值,对正常大鼠的血糖也有一定的降低作用,可调节糖尿病大鼠和正常大鼠的血糖水平[7]。在帮助降低血糖方面,每一位糖尿病患者降糖效果不太一样。可分三类:①有39%的患者(Ⅱ)型,在服用蜂胶一周左右,血糖指标就可以恢复正常水平;在巩固治疗一段时间后,相当一部分患者停止用药后,疗效依然稳定;②有55%的患者(Ⅰ型和Ⅱ型)需要在原来治疗基础上服用蜂胶,这部分患者,在加服蜂胶后,可以使一直居高不下的血糖逐步下降。而且对于Ⅰ型糖尿病患者,服用蜂胶后可逐渐减少胰岛素用量;③还有6%的患者不管怎么服用蜂胶,血糖基本没有改变。

  第二,防治心脑血管病。蜂胶通过对脂类和蛋白质的代谢的调节作用,能降血脂、软化血管、改善微循环、防止视力下降及心脑血管并发症。一些糖尿病患者坚持服用蜂胶制剂,4周后四肢发麻现象逐步消失;1—2月后,血脂显著降低。

  2)调节免疫水平

  蜂胶在全面的调节机体免疫功能,增强机体抗御能力和适应能力,防止各种并发症起到重要作用。

  3)抗病毒、抗菌

  蜂胶有抗菌、抗病毒作用。消除炎症,治疗感染,预防和治疗感染性并发症。糖尿病患者坚持使用蜂胶,可有效预防各种感染,使久治不愈的感染得到控制。

  4)增加生物酶活性、抗氧化

  蜂胶不仅有利胰岛素β细胞活力提高,恢复分泌胰岛素能力,还可提高胰岛素的敏感性,这些都是以蜂胶能促进细胞再生为基础。另外蜂胶具有抗氧化能力,能防止脂类的氧化,保证血液循环的畅通。

  5)细胞新生

  蜂胶使受损细胞再生,利于损伤修复,这是从根本上治疗糖尿病的希望所在。

  6)恢复体力

  恢复体力、消除“三多一少”症状。糖尿病患者在服用蜂胶一段时间后,多数体力明显恢复,而且“三多一少”症状逐步得到改善。

  3 蜂胶治疗糖尿病的机制

  蜂胶预防和治疗糖尿病的机理和途径主要有以下几方面[8-12]:

  1)蜂胶黄酮类、萜烯类物质具有促进利用外源性葡萄糖合成肝糖原的作用,而且,这类物质中的梓醇、蝶芪等物质具有明显的降低血糖的作用[13]。 研究还发现,蜂胶对正常大鼠和人的血糖没有影响,说明蜂胶具有双向调节血糖的作用。

  2)蜂胶有很好的杀菌消炎作用,能够同时对细菌、真菌、病毒都具有杀灭和抑制的作用。服用蜂胶,不仅能防止病菌对细胞的侵染,并对发生病变的细胞及组织有治疗和修复作用。具体可表现为:

  第一,糖尿病的病因之一是病毒性化学性物质刺激,导致胰腺功能障碍,使胰岛素分泌降低所造成的。蜂胶具有较强的抗菌、抗病毒作用,可提高其组织活性。

  第二,预防和治疗细菌感染性并发症,糖尿病患者免疫能力较低,再加上血液中含有大量的糖分,很容易被病菌感染,引发炎症,轻者伤口久治不愈,重者组织坏死,导致截肢。

  因此,坚持服用蜂胶可以恢复胰岛细胞功能。

  3)蜂胶是一种很强的天然抗氧化剂,能防止脂类的氧化,保证血液循环的畅通。具体可表现为[4]:

  第一,在减少脂肪堆积,起到减肥作用的同时,使脂肪细胞的胰岛素受体数量及敏感性提高,起到降糖作用。

  第二,增强SOD的活性,清除自由基,防止脂质氧化,保护胰岛β细胞免受自由基攻击。

  第三,在新兴的“植物化学物”学说中指出黄酮类化合物本身就是营养性抗氧化剂,多酚类也是抗氧化剂,它们有显著的抗氧化、抑制因自由基损害而产生的多种疾病。

  4)蜂胶有加强药效的作用,在注射胰岛素或服用一般降糖药品降糖效果不好时,可以在原来治疗基础上加服蜂胶,经过一段时间服用,就可明显降低血糖水平。

  5)糖尿病人大多伴随高血脂症,血管老化速度比正常人快,很容易引发微循环障碍、脑血栓、心脏病、心脑血管系统并发症。蜂胶中丰富的黄酮类物质通过清除血管壁上的沉积物,增强血管张力、通过降低胆固醇含量来使血液粘稠度降低,使血流逐渐变得畅通。具有很好的降血脂、降低毛细血管的渗透性、软化血管、保护血管的作用。这类物质抗氧化性能很强,是对付自由基的有力武器,能够保护血管不受自由基的侵蚀,保护血.管不过早变脆、变硬、失去弹性。

  6)蜂胶中的黄酮类、甙类等物质,可增强三磷酸腺苷酶活性(卡明斯基,1977),刺激机体产生更多的ATP。ATP是机体能量的重要来源。可见蜂胶可直接影响机体生理功能。有供应能量、恢复体力的作用。

  7)蜂胶中的黄酮类物质、多糖物质具有调节机体代谢,增强机体免疫能力的作用。免疫能力增强是提高机体抗病能力、提高整体素质、防止并发症发生的重要基础。具体机理[4]:

  第一,刺激抗体产生,使血清总蛋白和丙种蛋白增加,从而对抵御疾病的产生起直接作用。

  第二,增加白细胞和巨噬细胞的吞噬能力,从而直接消灭体内的“坏分子”。

  8)国内外学者研究表明,蜂胶中丰富而比例平衡的钙、镁、锌、铬等化学元素,对糖尿病有特殊意义。钙能影响胰岛素的分泌与释放;镁参与胰岛素细胞功能调节;锌可以维持胰岛素的结构和功能;铬可以激活胰岛素、改善糖耐量。

  9)蜂胶可调节与糖代谢有关酶系的释放及其活性,干扰小肠对糖的吸收,使餐后血糖峰值后移与降低,非常有利于糖尿病患。

  10)蜂胶抑制醛糖还原酶(AR)、a一葡萄糖酶(GA)的活性、抑制蛋白糖基化,从而对抗糖尿病。因为AR的激活和大量存在会导致体山梨醇大量积累,而山梨醇正是导致糖尿病并发症的主要原因,抑制AR,就可抑制山梨醇的产生,从而抑制并发症。蜂胶抑制GA,实际抑制葡萄糖过多产生,从而降低血糖。

  11)蜂胶使受损细胞再生,利于损伤修复,具体机制为:

  第一,促进损伤胰岛β细胞的修复,从而使胰岛功能恢复,并促进残存的胰岛β细胞分泌胰岛素,有可能还提高了胰岛素作用的靶细胞受体。这是糖尿病患者恢复的重要基础,也是糖尿病患者保持健康长寿的最可靠的基石。

  第二,激活细胞有丝分裂,使坏死组织尽快脱落,加速创口愈合。这是糖尿病患者并发症痊愈的保证,从而减少并发症对机体的损害。

  12)蜂胶是通过修复受损的神经细胞,清除神经细胞内堆积的糖醇,从而使神经功能正常的发挥功能,各种信号得到正常传输、调节机体各种神经系统紊乱的。 

  现在几乎还没有一种药物是针对糖尿病并发症而研制的,没有一种方法能够有效地对并发症进行治疗,因此,《实用内科学》上才说“现代医学对糖尿病并发症的治疗显得苍白而无力”。而实践证明蜂胶不仅能够治疗并发症,而且可以治疗所有的并发症,且效果突出。且无任何毒副作用,与现在常用的降糖药物比较蜂胶无论是在降糖还是在副作用方面,都有着不可比拟的优势,故采用蜂胶作为防治糖尿病的方法是十分可行的,而且全世界的研究也发展很快,相信蜂胶在糖尿病的防治上会取得更大成功。 

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